介绍
可变长度的DNA片段(DNA探针)能够与互补的核酸链形成非共价、高度特异的双链(称为杂交)。当一个标签附加到这样一个杂交探针的检测可以有效地服务于定义目标DNA序列标记DNA探针通常用于原位杂交实验研究和临床诊断特定染色体的DNA序列,以及潜在的畸变(突变。缺失和/或重复)被检测到并定位在固定的组织和细胞内。
原位DNA的可视化要么通过荧光读数(荧光原位杂交(FISH))，要么通过显色检测(显色原位杂交(CISH))，这依赖于酶促反应导致有颜色的底物沉淀。
原位杂交中对DNA探针的标记通常是使用标记DNA聚合酶(=聚合酶链反应(PCR))或DNA酶I/ DNA聚合酶1的混合物(-NT)(表1)
表1原位杂交DNA探针可通过Nick Translation或PCR酶标
| Nick Translation | PCR | |
| 原则 | DNA酶 I在dsDNA中引入随机单链断裂('nicks ')，随后由DNA聚合酶I填充，使用标记的dNTP作为其天然配对物的替代物 | 一段特定DNA片段的扩增(用特定引物或多段DNA进行PCR)利用Taq聚合酶掺入标记的dNTP取代其自然对应物的位点(用退化寡核苷酸引物进行PCR (dopo -PCR)) |
| 模板 | 线性化的dsDNA的pmol量 | 线性化的dsDNa的fmol数量 |
| 标记片段大小 | 100–500 bp dsDNA | up to 1500 bp |
| 扩增 | 否 | 是 |
荧光dUTP & dCTP
荧光dUTP和dCTP可用于酶促标记DNA探针一步完成。标记后的DNA探针可通过荧光显微镜或光谱直接显示。组合标记，例如用不同或独特的荧光团标记探针，允许同时显示多个目标(多路复用)41荧光团的选择取决于可用的激发源、滤光片组、应用(单色或多色成像)(表2)和所需的酶标技术(Nick Translation或PCR)(表3)。
荧光团的光稳定性和亲水性都是决策时需要考虑的关键参数。例如，光稳定性提高的荧光团一般可以增加灵敏度，从而提高目标序列的检测极限。然而，荧光团的亲水性直接影响相应标记的dUTP和dCTP的基材性能用亲水(如Cy3)或中度疏水染料(如德州红)标记的dUTP和dCTP是PCR和Nick翻译标记的理想选择。相反，疏水荧光载体(如ATTO0647N)会导致DNA扩增的提前终止，很可能是由于染料-dve或染料-酶的相互作用，因此仅推荐用于Nick Translation。
表2所选荧光染料的光谱特性。++:好，+:中等，-:poon请注意:呋酚的性能取决于呋酚的应用，呋酚是亲水性和光稳定性之间的一种承诺，这分别决定了亲水性和光稳定性的亲水性和检测灵敏度。
表3酶合成的荧光dUTP和dCTP。n / a:不适用
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