疏水作用层析 (HIC) 是在蛋白天然的状态下用于分离纯化蛋白使用最为广泛的方法。HIC也被证明是非常有用的工具在分离蛋白复合物和研究

蛋白折叠和解折叠。因此，HIC如何发挥作用? 在技术后面的原理是什么? 去理解在这类色谱后面的原理，如下几点你肯定需要了解。

HIC如何发挥作用?

      简言之，HIC (也叫盐析)使用疏水性的特点来分离蛋白. 在这个方法操作中，包含亲水和疏水区域的蛋白在高盐缓冲液条件下加入到HIC柱子

中。缓冲液中的盐 (通常是硫酸铵)降低了样本溶质的溶解 从而暴露出了蛋白分子表面的疏水区域。这协助这些疏水区域到柱子固相支撑物疏水区域

的吸附，最终使溶液中的蛋白沉淀（结晶）出来.请记住当进行这种类型的色谱时, 加入的感胶离子盐增强了疏水效果同时降低了单独疏水区域数量

和体积。当降低盐浓度会导致从固相支持物上的解吸附. 以此类推，样品的洗脱可以通过降低盐的浓度来实现。温和的有机溶液修饰剂或去污剂或

许也可以加到洗脱液中来协助洗脱的过程。使用HIC的原理, 你可以从水溶液中在各种程度下结合蛋白，结合程度取决于目标蛋白的结构，盐浓度，

PH值，温度和使用的有机溶剂。

疏水作用层析: 揭示潜在的理论 

      有三种主要的理论能够帮助解释在HIC背后的机理 – (1) 盐析理论 (2) 热动力学理论以及 (3)表面张力或范德华力理论.

盐析理论

       根据盐析理论, 这些疏水氨基酸行成被保护的疏水区域一旦在水溶液中发生折叠然而亲水性氨基酸允许蛋白去和水中的氢键发生结合。 结果是

溶解在水中的蛋白会增加如果有足够的亲水区域存在于蛋白分子表面.

       然而，一旦在溶液中加入抗离液剂盐 (比如硫酸铵和硫酸钠), 一些水分子将会和盐离子发生作用而不是和蛋白质的电荷部分. 当溶液中蛋白和

蛋白的相互作用比溶剂溶质的相互作用更加强的话, 蛋白分子会和另外一个蛋白分子自由发生相互作用 – 从而使他们发生集结最终从溶液中沉淀出

来。因此，溶液中盐的加入在不同程度上降低了不同蛋白的溶解性。

热动力学理论 

      这个理论说明疏水分子之间的相互作用是一个熵驱动的过程，基于热动力学第二定律。在一种极性溶剂中两个或多个非极性分子之间的疏水作

用是一种熵变化的自发过程。然而，这种作用可以通过控制温度或修改溶剂的极性来发生改变。

     因此，当一种非极性的分子和一种极性的溶剂比如说水接触的时候,围绕着疏水性分子的溶剂分子会有一定程度的增加。只要焓不显著增加，这

会导致熵的降低同时会给吉布斯能一个正向的变化。 同样，非极性分子溶解到极性溶剂中不会发生自发的反应因为这不是热动力学倾向性的.

     然而，当你将两种或更多种非极性分子放到一个极性的环境中, 大分子的疏水表面会从极性环境中隐藏起来，同时疏水分子会自发的发生聚集。

这种高度结构性的溶剂分子周边被暴露出来的疏水分子的表面所环绕将会被包含少量结构分子的大量溶剂所替换。造成的结果是，熵增加同时吉布

斯能降低。在这种情况下，疏水作用变成一种热动力学倾向性的过程。

表面张力，范德华力理论

     这种理论认为在HIC中的疏水作用是取决于蛋白和固定的配基之间的范德华力因为在盐析盐的存在下，随着水的有序结构的增加这些力会增加