NEB E6300S cDNA 链合成试剂盒 cDNA合成

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ProtoScript® cDNA 链合成试剂盒含两种经优化的混合液：M-MuLV 酶混合液和 M-MuLV 反应混合液。M-MuLV 酶混合液含 M-MuLV 反转录酶和小鼠 RNase 抑制剂，M-MuLV 反应混合液含 dNTP 和经优化的缓冲液。该试剂盒还包含两种优化的反转录引物和无核酸酶水。锚定的 Oligo-dT 引物 [d(T)23VN] 迫使引物与 polyA 尾的起始端退火。经优化的随机引物混合液能随机并持续性地与整个 RNA 模板配对，包括 mRNA 和无 polyA 尾的 RNA。合成的 链 cDNA 产物长度可超过 10 kb

成功合成 cDNA 的要素：

RNA 模板
高纯度的完整 RNA 对于灵敏的 RT-PCR 检测至关重要。RNA 的 A260/A280 比值应至少 1.7 或更高。

总 RNA 或 mRNA 均可用于反转录反应。总 RNA 通常足以进行大多数 RT-PCR 分析。不过，如果需要，可以使用 PolyA Spin mRNA 分离试剂盒（NEB #S1560）或 mRNA 磁性分离试剂盒（NEB #S1550）获得 mRNA。

检测所需的 RNA 量取决于目标转录本的丰度。通常推荐使用 1 ng 至 1 μg 的总 RNA 或 0.1-100 ng 的 mRNA。

cDNA 链合成反应
RNA 和引物在 70℃ 条件下变性 5 分钟，可以去除阻碍较长 cDNA 合成的二级结构。不过，可以在某些情况下省略此步骤（结果未发表）。

推荐在 42℃ 条件下温育一小时，以获得 产量和 长度。不过，许多靶标用较短的温育时间即可进行检测。例如，对于 2 kb cDNA 合成，温育 5 分钟就足够了。

选择反转录引物
Oligo d(T) 引物是大多数实验的首·选，因为它确保所有 cDNA 拷贝在 mRNA 的 3′ 端终止并产生最长的连续 cDNA。锚定的 Oligo-dT 引物 [d(T)23VN] 迫使引物与 polyA 尾的起始端退火，从而防止在 polyA 尾的内部位点开始退火（1）。不过，如果需要，也可以选择另外两种引物。

随机引物混合液是经优化的六聚体和 d(T)23VN 引物混合液。该混合液能随机地与整个 RNA 模板配对，包括 mRNA 和无 polyA 尾的 RNA（例如核糖体 RNA）。随机引物混合液产生的 cDNA 平均长度较短，可用于检测多个短 RT-PCR 产物。随机引物混合液在各种 RNA 模板中均具有良好的性能。

基因特异引物用于 cDNA 合成反应时，cDNA 产物只能用于扩增该转录本。RNA 起始量较低（低于 10 ng）且只需要一种特定的 cDNA 时，使用这种方法可以获得良好的结果。

推荐的引物浓度：
引物：终浓度
OLIGO d(T)23VN：5 μM
随机引物混合液：6 μM
特异引物：0.1–1 μM

NEB E6300L ProtoScript® cDNA 合成试剂盒 逆转录试剂盒

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